常规电镜样品制备标准方法

常规电镜样品制备包括常温化学双固定、常温脱水包埋、常规超薄切片、普通电镜观察几个步骤。样品制备过程历时约一周，超薄切片经醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色后，电镜观察。所有操作均按照以下流程进行。

试剂

0.2 mol/ L磷酸盐缓冲液

Na2HPO4·2H2O  35.61 g 或Na2HPO4·7H2O 53.65 g / Na2HPO4·12H2O 71.64 g

NaH2PO2·H2O  27.60 g 或NaH2PO4·2H2O  31.21 g

加双蒸水（ddH2O）到1000 mL

0.1 mol/ L磷酸盐缓冲液（PBS）

0.2 mol/ L磷酸盐缓冲液  250 mL

加双蒸水到500 mL

2 % 低温琼脂

低温琼脂  1.0 g

加双蒸水到 50 mL

加热到沸腾，溶液均匀后备用

1 % 戊二醛固定液

25 %（m/v）戊二醛水溶液  2 mL

0.2 mol/ L磷酸盐缓冲液  25 mL

加双蒸水到50 mL

1 % 锇酸固定液

2 %（m/v）锇酸水溶液   10 mL

0.2 mol/ L磷酸盐缓冲液  10 mL

包埋剂A液

Epon 812 树脂  50 mL

十二烷基琥珀酸酐（modecenyl succinic anhydride, DDSA）  80 mL

包埋剂B液

Epon 812 树脂  50 mL

六甲酸酐（methyl nadic anhydride, MNA）  44.5 mL

2，4，6 - 三甲氨基甲基苯酚（2, 4, 6 - tridimethylamino methyl phenol, DMP-30）

甲苯胺蓝染液

甲苯胺蓝  1 g

1 mol/ L NaOH  10 mL

加双蒸水到50 mL

混匀过滤后使用

1 % 醋酸双氧铀染液

醋酸双氧铀  0.2 g

加双蒸水到10 mL

封口膜封口，4℃避光保存

1 % 柠檬酸铅染液

硝酸铅  0.265 g

柠檬酸钠（含2分子结晶水）  0.352 g

加双蒸水到10 mL①

① 配制铅染液时，要先加水6 mL，超声震荡30 min，使乳白色柠檬酸铅悬液充分混匀。然后滴加1 mol/L NaOH，并不是晃动，直至溶液变清亮。最后定容至10 mL。

② 细胞样品处理和藻类及其他游离样品处理流程可相互参照，即细胞样品可以酌情使用琼脂铸模法取材固定，藻类及其他游离样品也可以使用血清预包埋法取材固定，总体视样品密度及其对于温度的耐受等条件而定。

封口膜封口，4℃保存

仪器

修块机 Leica EM TRIM

切片机 Leica EM UC6

光学显微镜 Nikon 80i 及配套拍照系统DS-L1

透射电子显微镜 JEOL-1230

Gatan Bioscan Camera 792

实验流程

一、 取材与固定

A. 植物样品

1. 自来水冲洗表面泥尘后，使用灭菌水清洗2-3次，置于铺有预湿滤纸的培养皿中。

2. 使用干净锋利的刀片切取目标材料，所取材料体积不大于3 mm3。

切取样品时应注意动作迅速、减小损伤，避免来回切拉；使用的灭菌水及器具应4℃预冷，并在操作中尽量保持低温以降低组织细胞活性。

3. 将切下材料放入装有预冷的戊二醛固定液的青霉素小瓶中后抽气，抽几次后轻摇小瓶，并打开瓶盖。重复2-3次，直到样品沉入瓶底。

4. 室温静置1h，或摇床轻摇1h。

5. PBS清洗3次，10min/次。

6. 1%锇酸固定液固定1h。

7. PBS清洗3次，10min/次。

B. 动物样品

1. 4℃预冷生理盐水冲洗组织块，迅速切取组织块，体积不大于3 mm3

2. 将切取的组织块投入装有预冷戊二醛固定液的青霉素小瓶中，并抽气直至样品沉底。

3. 室温静置1h，或摇床轻摇1h。

4. PBS清洗3次，10 min/次。

5. 1%锇酸固定液固定1 h。

6. PBS清洗3次，10 min/次。

C. 单层培养细胞或悬浮培养细胞样品②

1. 3000 rpm离心5 min，收集细胞样品，尽量多的吸弃培养液上清。

2. 加入4℃预冷PBS液，充分吹吸混匀，静置4 min，3000 rpm离心5 min，吸弃上清。

① 配制铅染液时，要先加水6 mL，超声震荡30 min，使乳白色柠檬酸铅悬液充分混匀。然后滴加1 mol/L NaOH，并不是晃动，直至溶液变清亮。最后定容至10 mL。

② 细胞样品处理和藻类及其他游离样品处理流程可相互参照，即细胞样品可以酌情使用琼脂铸模法取材固定，藻类及其他游离样品也可以使用血清预包埋法取材固定，总体视样品密度及其对于温度的耐受等条件而定。

3. 重复步骤2一次。

4. 加入预冷的血清或蛋清，充分吹吸混匀，3000 rpm离心10 min，吸弃大部分上清，留少部分，吹吸悬浮沉淀细胞。（或离心后吸弃上清，留少部分上清，不悬浮沉淀细胞，视样品浓度而定）

5. 缓慢加入戊二醛固定液，小心放入4℃冰箱，固定过夜。

6. 吸弃上清，刀片小心划开离心管壁，用钳子拉开离心管，小心取出已凝成固体的血清包埋块。

7. 使用干净的单面刀片或手术刀，将血清包埋块切成2 mm3左右的小块，取3-5个富集细胞样品效果较好的包埋小块继续下面实验。

8. PBS清洗3次，10 min/次。

9. 1%锇酸固定液固定1 h。

10. PBS清洗3次，10 min/次。

D. 藻类及其他游离培养样品

1. 吸取2%低温琼脂液200μL到0.2mL离心管，并将离线管置于冰上，取10μL枪头迅速插入琼脂中并保持离心管竖直，且枪头竖直靠中的包裹在琼脂中。

2. 静置1 min，待琼脂凝固后，小心拔出枪头，形成琼脂空腔，待用。

3. 3000 rpm离心5 min，收集样品，尽量多的吸弃培养液上清。

4. 加入4℃预冷PBS液，充分吹吸混匀，静置4min，3000 rpm离心5min，吸弃上清。

5. 重复步骤2清洗，吸弃大部分上清，留极少部分上清液，吹吸悬浮样品。

6. 使用10μL 移液器小心将样品加入已经制备好的琼脂空腔中，使样品充满空腔大部分，添加过程中尽量避免气泡出现。

7. 吸取50μL溶化的琼脂，快速滴加到空腔琼脂上封口，冰浴5 min，待琼脂完全凝固。

8. 使用单面刀片小心划开离心管壁，用钳子拉开离心管，小心取出已凝成固体的琼脂包埋块，稍作修葺。

9. PBS清洗3次，10 min/次。

10. 1%锇酸固定液固定1 h。

11. PBS清洗3次，10 min/次。

二、 脱水

1. 按丙酮与灭菌水体积比3：7配制30%脱水剂。吸弃样品管/瓶中的PBS，快速加入现配的脱水剂（脱水换液过程禁止出现样品暴露空气中现象，可不全部吸完，略有剩余，使样品浸润；动作应迅速准确），室温放置或摇床轻摇45 min。加入按30%、50%、70%、90%、100%（v/v）的浓度梯度进行脱水。

2. 配制50%脱水剂，快速换液，室温轻摇45 min。

3. 配制70%脱水剂，快速换液，室温轻摇45 min。

4. 配制90%脱水剂，快速换液，室温轻摇45 min。

5. 使用纯丙酮快速换液，室温轻摇30 min③。

6. 重复步骤5一次。

三、 渗透包埋

在此步脱水操作完成后即可开始配制渗透用包埋剂，以免安排不周。样品浸泡在纯丙酮中时间不宜过久，以免造成样品较脆，不利于超薄切片。

1. 配制渗透用树脂包埋剂

1) 取干净的10 mL注射器，拔去活塞，用封闭针头堵住注射口，放于通风橱中。

2) 小心倾倒B液9 mL到注射器中；然后再小心倾倒A液1 mL。

3) 插入活塞，堵住注射器后，颠倒摇匀至液体颜色均匀，无丝状液体。

4) 小心拔去活塞，通风橱中操作，缓慢滴加14滴DMP-30。

5) 插入活塞，堵住注射器后，颠倒摇匀至液体颜色完全均匀，无丝絮状分色，竖直放置待用。

2. 按照包埋剂与丙酮体积比3：7配制30%渗透剂，快速吸弃样品管中纯丙酮并加入渗透剂，轻摇渗透3 h。

3. 按照包埋剂与丙酮体积比7：3配制70%渗透剂，快速换液，轻摇渗透过夜。

4. 重新配制包埋剂，并小心推按注射器，将包埋剂挤到包埋模具中至液面略凸。

5. 解剖针挑取样品到纯包埋剂中，渗透3 h。

6. 小心挑取样品，滤纸上稍微沾下吸弃部分粘附的包埋剂，轻轻放置到未渗透过样品的包埋孔中，小心将样品按到底，摆放好位置。记录各样品对应包埋块编号。

7. 梯度温度聚合包埋

1) 37℃烘箱中12 h，期间定时观察样品有无漂移现象，如有，则再次小心摆放样品位置。

2) 45℃烘箱中12 h。

3) 60℃烘箱中24 h。

四、 修块与切片

1. 拿到包埋块后检查样品位置是否得当，选取位置好的包埋块优先进行修块、切片。

2. 粗修包埋块

1) 使用六角扳手将包埋块固定在样品头上，露出长度合适。

2) 将样品头固定在修块机上，体视镜观察修块，分四个方向将包埋块头部多余的包埋剂修去，暴露出组织块。

3) 使用锋利的单面刀片修去组织块周围毛刺的包埋剂，使其四边光滑清晰。

4) 卸下样品头装至切片机上，使用玻璃刀修片，直至样品表面光滑清晰。

3. 半薄切片

1) 将粘有水槽的玻璃刀装至切片机刀台上，体视镜下小心对刀，不时转动手轮，使样品上下移动，调整刀台左右角度及样品上下角度，直至包埋块整个表面与刀刃的距离相等。

2) 转动手轮，使整个样品高于刀刃，点控制面板Start，设置切片区域上边界；转动手轮，使整个样品低于刀刃，点控制面板End，设置切片区域下边界。

3) 手动步进刀台靠近样品，至出现彩色干涉光，继续步进刀台，并通过体视镜观察干涉光谱变化，直至干涉光消失。

4) 转动手轮，使样品离开刀刃区域，使用滴管将干净的去离子水加到玻璃刀水槽中，体视镜观察直至液面略低于刀刃。

5) 调整切片厚度与速度，按控制面板Run/Stop键，开始切片。体视镜观察可见900nm厚度切片反光为亮绿色。

6) 待有切片下来形成4-6片的切片带，按Run/Stop键停止切片，体视镜观察下，使用睫毛笔将所需薄片拨离刀刃，并将所需切片聚拢一起。

7) 用干净捞片环轻轻沾取切片所在区域，根据水膜表面张力捞取切片，放到干净载玻片上，酒精灯略微加热，使水蒸干，并对着光亮用记号笔标示切片所在位置。

4. 半薄切片染色

1) 吸取20μL甲苯胺蓝染液，滴加到载玻片放有切片的位置，室温静置30 s 。

2) 去离子水冲洗玻片，直至不再有蓝色。吸水纸上沥干，酒精灯略微加热，加速切片上的水分蒸发。

3) 显微镜观察切片质量和样品位置。

5. 精修包埋块

1) 移去装有水槽的玻璃刀，取下装有包埋块的样品头，装至修块机上。

2) 根据半薄切片结果，使用新的锋利刀口，小心修理包埋块四边，使其尽可能的光滑、平整。

6. 超薄切片

1) 将钻石刀装至切片机刀台上，体视镜下小心对刀，不时转动手轮，使样品上下移动，调整刀台左右角度及样品上下角度，直至包埋块整个表面与刀刃的距离相等。

2) 转动手轮，使整个样品高于刀刃，点控制面板Start，设置切片区域上边界；转动手轮，使整个样品低于刀刃，点控制面板End，设置切片区域下边界。

3) 手动步进刀台靠近样品，至出现彩色干涉光，转动手轮，使样品上下移动，调整刀台左右角度及样品上下角度，直至包埋块整个表面与刀刃的干涉光谱颜色一致；继续步进刀台，并通过体视镜观察干涉光谱变化，直至干涉光消失。

4) 转动手轮，使样品离开刀刃区域，使用滴管将干净的去离子水加到玻璃刀水槽中，体视镜观察直至液面略低于刀刃。

5) 调整切片厚度与速度，按控制面板Run/Stop键，开始切片。体视镜观察可见70nm厚度切片反光为亮灰色及浅灰色。

6) 待有切片下来形成10-20片的切片带，按Run/Stop键停止切片，体视镜观察下，使用睫毛笔将所需薄片拨离刀刃，并将所需切片聚拢一起。

7) 用干净捞片环轻轻沾取切片所在区域，根据水膜表面张力捞取切片，轻轻放到干净载膜铜网上，用尖角滤纸靠近铜网边缘缓慢吸干水分。

8) 轻轻移去捞片环，将载有切片的铜网放到铺有滤纸的平皿中，晾干待染色观察。

五、 染色

1. 醋酸双氧铀染色

1) 按每片载网20μL染液的量吸取醋酸双氧铀染液，13 200 rpm离心5 min。

2) 将放有切片的载网小心放到染色盘上，有切片面靠上，并稍微用镊子按载网边缘，使其与染色盘接触粘附牢固。

3) 吸取20μL染液滴加到载网上面，盖上平皿防尘，室温染色30 min。

4) 将染色盘整个放到装有去离子水的清洗缸中，轻摇清洗1 min。

5) 小心取出染色盘，更换水洗液，轻摇清洗5min。

6) 重复清洗2次。

2. 柠檬酸铅染色

1) 按每片载网20μL染液的量吸取醋酸双氧铀染液，13 200 rpm离心5 min。④

2) 在放置染色盘的平皿中放入2片固体NaOH，用以吸收平皿中CO2气体。

3) 吸取20μL染液滴加到载网上面，盖上平皿防尘，室温染色8 min。

4) 将染色盘整个放到装有去离子水的清洗缸中，轻摇清洗1 min。

5) 小心取出染色盘，更换水洗液，轻摇清洗5min。

连续染色时，载网不需要从染色盘上拿下，清洗后直接进行铅染即可，但是铅染液要现用现取。

6) 重复清洗2次。

7) 小心夹取载网，放置到铺有滤纸的干净平皿中，晾干待电镜观察。

六、 电镜观察

1. 取出样品杆，打开样品夹，小心放入载网，合上样品夹，并转动样品杆，轻敲确保样品夹已准确固定载网。

2. 将样品杆插入透射电镜样品室，开始抽气。

3. 打开灯丝开关，等待检测电流出现后，打开观察窗开始观察。

4. 先在低倍下找到切片，再高倍观察切片，寻找待看目标，仔细对焦。

5. 将切片目标区域遇到观察窗中间后，调整灯丝电流密度为3.8 pA/cm2。

6. 插入拍照CCD，Start View，微调焦距，Start Acquire 拍照。

7. 拍照完毕，按格式需求保存照片到指定文件夹。

8. 使用专用写保护闪存盘拷贝数据到公共电脑观察、使用。

常规透射电镜生物样品制备步骤

一．取材：

组织块小于1立方毫米

二．固定：        

2.5%戊二醛，磷酸缓冲液配制固定2小时或更长时间。

用0.1M磷酸漂洗液漂洗         15分 三次

1%锇酸固定液固定                2-3小时

用0.1M磷酸漂洗液漂洗         15分 三次

三．脱水：        

50%乙醇                        15-20分

70%乙醇                        15-20分

90%乙醇                        15-20分

90%乙醇 90%丙酮（1：1）        15-20分

90%丙酮                        15-20分

以上在4度冰箱内进行

100%丙酮         室温         15-20分三次

四．包埋：        

纯丙酮+包埋液（2：1）室温 3-4小时

纯丙酮+包埋液（1：2）室温 过夜

纯包埋液                 37度 2-3小时

五．固化：        

37度烘箱内                 过夜

45度烘箱内                 12小时

60度烘箱内                 48小时

六．超薄切片机切片70 nm

七．3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色

八．透射电镜JEOL  JEM-1230（80KV）观察。拍片。

JEM-1230

EM-1230是日本电子主要运用于生命科学的120kV透射电子显微镜，其显著特点就是电子光学系统稳定、操作系统的智能化和各种分析方法的扩展性。样品损伤和污染减小，图像质量高。预对中灯丝，更换简单无需调整。点分辨率0.36nm。高衬度物镜极靴。放大倍率50倍-60万倍。

1. 晶格分辨率：0.38nm

2. 加速电压40kV-120kV

3. 电子枪：冷束电子枪

4. 灯丝：钨灯丝或LaB6灯丝

5. 放大倍数：50-1,200,000

6. 样品台：标配五轴马达驱动样品台

7. 样品移动范围：X/Y,2mm；Z,1mm;最大倾斜角，±70度

HT7700

HT-7700具有高反差、高分辨图像观察与强大的分析扩展功能，提供高对比度，高分辨率成像和分析，具有大视场全景成像功能，广泛应运于生物、制药、纳米技术和软材料等领域。CCD相机与显微镜主机的操作相统一，可以在显示器画面上轻松、简便地进行操作，还能在明亮的室内进行观察。

1. 加速电压：120KV；放大倍数：50 -600,000倍；高反差模式：200–200K倍；高分辨模式：4K - 600K倍。点分辨率：0.36nm；线分辨率：0.204nm；电子枪：W灯丝；样品倾斜角度：±30°

2. 具有双系物镜可相互切换高分辨模式和高衬度模式。

3. 高分辨模式的焦距是3.1mm，高衬度模式的焦距是6.5m，切换无需等待。

4. TEM操作统一于显示器上，无需直视荧光板，实现了无胶片化，可以在明亮的室内进行观察，以往在荧光板上发暗而难于识别的图像在显示器上也能够实现清晰地显示。

5. 图像导航，自动驱动，位置记录。

6. 标配图像拼接功能(图像偏移、多级移位)与录像功能，自动漂移校正功能，自动预辐照，消除色差。

7. 标配涡轮分子泵(TMP)真空系统，实现真空系统清洁化。

对实验人员身体有伤害的样品（致病菌，可传染病毒等），含磁性（铁、钴、镍等）物质的样品，等所有不宜制作超薄切片、不宜透射电镜观察的样品，恕不接受。

透射电镜样品取材须知

取材是电镜样品制备的第一步，也是十分重要的一步。其操作成功与否直接关系到整个实验的成败。

一.取材的基本要求：快、冷、小、净、准。

　　快：就是指在血液未停止流动（未凝血）前取材。因为一旦组织失去血流供应，细胞就处在缺氧状态，代谢发生改变，细胞内的一些酶将释放出来使细胞自溶，破坏超微结构形态。所以当组织离体后应即刻予以固定。

　　冷：在取材时尽量保持低温操作，使酶的作用降低，减少对细微结构的影响。一般要求取材温度控制在0-4℃。

　　小：由于受电镜固定液及包埋剂渗透速度的影响，因此，一般不允许组织块的大小超过1mm3。取材时动作要轻，刀锋要利，切组织时刀片沿着一个方向切，避免任何牵拉和挤压造成的机械损伤。

　　净：尽量少带血液和组织液进入固定液。但切忌用水直接冲洗，可用缓冲液（0.1M PBS）或等渗盐水（0.9%NS）把表面的血液和组织液轻轻冲掉。

　　准：为避免“一孔之见”等电镜研究固有的局限性，要求在取材时选择部位准确可靠，即取材的组织小块必须为要求观察的部位。

二. 具体方法：

　　1.组织固定法：

固定组织的方法为心脏灌注法，固定液的选择与不同的神经递（调）质有关，一般来说，对于神经肽以及分子量较大的多肽和蛋白质，用含4%多聚甲醛、0.1-0.5%戊二醛或0.2%苦味酸的0.1M磷酸缓冲液(PB)(PH7.2-7.4)。组织固定法以大鼠为例，首先用50毫升生理盐水（37℃）清洗血液，接着用50毫升固定液（37℃）快速灌注固定，然后用250-300毫升冷固定液（4℃）慢速灌入，持续10-15分钟后取材，置组织于同样固定液中，在4℃冰箱中后固定。

　　2.振动切片：

将所需组织修成适当大小的组织块，为了易于切片，组织块的高度不应超过其长或宽度，用502胶将组织粘于振动切片机的样品台上，尽量将组织块中的重要部分迎向切片刀口（市场上的双面剃须刀）。切片厚度为50-70微米。

　　3.实质性器官：实质性组织切成正方体小块2×2×2mm3。组织块被剪刀剪切或镊子夹过的部分弃去，然后用牙签将组织小块轻轻挑起，放入装有固定液的小管中浸泡固定。也可用镊子借液体的张力移取组织块，注意不可用力夹。小管置于4℃冰箱中保存。每份样本的组织小块需≥5块。例如：

肝脏：切除被膜，切成立方体小块。

肾脏：分为皮质与髓质。根据实验的要求取相应部位，切除包膜，切成立方体小块。

肺脏：同肝脏取材，但因肺中有大量的肺泡及细支气管，所以在固定时小块会漂浮在固定液液面上，需用空针抽真空，使小块完全浸没在固定液中。

　　4.有方向性的器官：切成长方体小块（1×1×2 mm3）。    

注：观察面即为长方体小块的宽面（图上阴影部分）！

肠、血管：此类管腔型组织，在固定时要将其剖开，使内膜面得以充分的固定，如不剖开而直接浸在固定液中，由于固定液渗透时间的影响，进入内膜面需要一定时间，这样内膜面的超微结构已经改变。管腔型组织需切成长方体小块，

肌肉、神经：此类组织也存在横切和纵切的差别，所以也要切成长方体小块。

心脏：如果可辨清肌纤维方向，则按照肌肉取材。否则同肝脏取材。

　　5.培养细胞、细菌的电镜样品制备：

将细胞连同培养液放在尖头离心管中离心5min，2 000r/min，后弃上清液，加入4%多聚甲醛（0.1mPBS配制，pH7.4），并用滴管轻轻吹打，使细胞悬浮于固定液中，并在4℃下固定4h和过夜。由于电镜样本制备过程中会不可避免地损失掉一部分细胞，因此细胞必须达到一定数量，即为离心后细胞量至少为黄豆样大小。

组织：使用2 ml离心管（圆底），提供5个以上组织；

单细胞：使用1.5ml离心管（尖底），离心收集后黄豆大小。

样品统一编号1、2、3、……，n，并在管壁上注明送样人的姓名首字母。

样品取材要求：

（1）新鲜。（材料离体后1～5min内进入固定液，避免细胞自溶和结构变化）

（2）体积小。（厚度<1mm，长度宽度均<5mm，固定液渗透能力有限，组织太大会导致无法固定充分）

（3）机械损伤小。（动作轻巧，器械锋利，避免对阻止的挤压和推拉，建议用剃须刀片、手术刀片、手术剪刀。）

（4）低温操作，器械、容器、固定液均需预冷。（降低酶的活性，减少组织自溶）

（5）取材部位准确，且注意材料的方向性和定位。

取样操作：

戊二醛固定液：戊二醛（多为25%），超纯水配成10%的水溶液，-20℃可长期储存。

使用前加0.2 M磷酸缓冲液稀释至所需浓度（有细胞壁的样品使用浓度5%，无细胞壁样品2.5%，磷酸缓冲液终浓度为0.1M，PH约为7.2），现配现用。

*缓冲液浓度及PH，可根据文献和实验需要自行调节。

切取一小块组织或器官，置入预冷的戊二醛固定液中，4℃预固定20分钟后，捞出置于洁净的保鲜膜或培养皿上（已滴有预冷的戊二醛固定液），在固定液中用将组织切成2～5mm长， 2～3mm宽， 1mm厚的细条，移入盛有预冷的戊二醛固定液的2ml离心管中，4℃固定过夜。

  1.植物细胞的细胞壁和液泡会阻碍固定液迅速渗入。植物材料内部存有的空气，往往使材料漂浮于固定液面之上，由此影响到植物组织的固定效果。组织放入戊二醛固定液后，可用针筒或真空泵抽出组织内部的气体，使材料沉入固定液中。

  2.动物样本的取材，可将动物麻醉或急性处死后切取组织。或者采用原位固定、流灌固定后再切取所需组织。具体事宜请查询相关文献后操作。

多细胞组织块每个样品需提供5个以上，以免后续实验操作丢失。

使用2 ml离心管（圆底）。

3.细胞样品：离心收集后需有黄豆大小。

使用1.5ml离心管（尖底）。

1）液体培养：轻微并短暂离心培养液后收集细胞，加入新鲜缓冲液，低温1000rpm/min（离心力不可过大，离心时间不可过长，避免机械挤压导致细胞变形。也可根据具体情况调整）离心5min，弃上清。

滴加新鲜缓冲液重悬15min，低温1000rpm/min，离心5min，弃上清，重复2遍。

建议细菌样品采用液体培养的方式。

2）固体培养：从培养基上刮取细胞群落，加入新鲜缓冲液，低温1000rpm/min离心5min后，弃上清。

滴加新鲜缓冲液重悬15min，低温1000rpm/min离心5min，弃上清，重复2遍。

3）贴壁培养：轻轻刮下适量细胞，加入新鲜缓冲液，低温1000rpm/min离心5min后，弃上清。

滴加新鲜缓冲液清洗15min，低温1000rpm/min离心5min，弃上清，重复2遍。

收集后的细胞样品加入戊二醛固定液后重悬，4℃固定过夜后送样。

样品统一编号1、2、3、……，n，并在管壁上注明送样人的姓名首字母（铅笔）。

周四下午2-3点前送至中心样品接收处，过期不候。

更多事宜请电话联络。