随着科学技术的发展，实验技术已经成为实现实验目的的重要手 段，对实验技术的了解和掌握是科技工作者应具备的技能。 激光扫描共聚焦显微镜（Laser scanning confocal microscope）是 20 世纪 80 年代中期发展起来并得到广泛应用的新技术，它是激光、电子摄像和计算 机图像处理等现代高科技手段渗透，并与传统的光学显微镜结合产生 的先进的细胞分子生物学分析仪器，在生物及医学等领域的应用越来 越广泛，已经成为生物医学实验研究的必备工具。 在传统光学显微镜基础上，激光扫描共聚焦显微镜用激光作为光 源，采用共扼聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数 字图像处理观察、分析和输出。 其特点是可以对样品进行断层扫描和成像，进行无损伤观察和分析细胞的三维空间结构。 同时，利用免疫 荧光标记和离子荧光标记探针，该技术不仅可观察固定的细胞、组织 切片,还可以对活细胞的结构、分子、离子及生命活动进行实时动态观 察和检测,在亚细胞水平上观察诸如 Ca2+,pH 值,膜电位等生理信号及 细胞形态的变化,成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗 传学等领域中新一代强有力的研究工具，极大地丰富了人们对细胞 生命现象的认识。

 1.激光扫描共聚焦显微镜的原理 在普通宽视野光学显微镜中，整个标本全部都被水银弧光灯或氙 灯的光线照明，图像可以用肉眼直接观察。 同时，来自焦点以外的其 他区域的荧光对结构的干扰较大，尤其是标本的厚度在 2um 以上时， 其影响更为明显。 激光共聚焦显微镜脱离了传统光学显微镜的场光源和局部平面成像模式，采用激光束作光源，激光束经照明针孔，经由分光镜反射至物镜，并聚焦于样品上，对标本焦平面上每一点进行扫描。 组织样品中 如果有可被激发的荧光物质，受到激发后发出的荧光经原来入射光路 直接反向回到分光镜，通过探测针孔时先聚焦，聚焦后的光被光电倍 增管（PMT）探测收集，并将信号输送到计算机，处理后在计算机显示 器上显示图像。 在这个光路中，只有在焦平面的光才能穿过探测针 孔，焦平面以外区域射来的光线在探测小孔平面是离焦的，不能通过 小孔。因此，非观察点的背景呈黑色，反差增加，成像清晰。由于照明针 孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于 照明针孔与探测针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，即共 聚焦。 以激光作光源并对样品进行扫描，在此过程中两次聚焦，故称 为激光扫描共聚焦显微镜。

 2.激光扫描共聚焦显微镜的主要功能

 2.1 组织和细胞中的定量荧光测定 激光扫描共聚焦显微镜可以从固定和荧光染色的标本以单波长、 双波长或多波长模式，对单标记或多标记的细胞及组织标本的共聚焦 荧光进行数据采集和定量分析,同时还可以利用沿纵轴上移动标本进 行多个光学切片的叠加， 形成组织或细胞中荧光标记结构的总体图 像,以显示荧光在形态结构上的精确定位。 常用于原位分子杂交、肿瘤 细胞凋亡观察、单个活细胞水平的 DNA 损伤及修复等定量分析.

 2.2 细胞间通讯的研究 动物和植物细胞中缝隙连接介导的胞间通信在细胞增殖和分化 中起着重要作用。 激光扫描共聚焦显微镜可通过观察细胞缝隙连接分 子的转移来测量传递细胞调控信息的一些离子、小分子物质。 该技术 可以用于研究胚胎发生、生殖发育、神经生物学、肿瘤发生等过程中缝 隙连接通讯的基本机制和作用，也可用于鉴别对缝隙连接作用有潜在 毒性的化学物质。

2.3 细胞物理化学测定 激光扫描共聚焦显微镜可对细胞形状、周长、面积、平均荧光强度 及细胞内颗粒数等参数进行自动测定。 能对细胞的溶酶体、线粒体、内 质网、细胞骨架、结构性蛋白质、DNA、RNA、酶和受体分子等细胞内特 异结构的含量、组分及分布进行定量、定性、定时及定位测定。

2.4 细胞内钙离子和 pH 值动态分析 激光扫描共聚焦显微镜技术是测量若干种离子浓度并显示其分 布的有效工具，对焦点信息的有效辨别使在亚细胞水平显示离子分布 成为可能。 利用荧光探针，激光扫描共聚焦显微镜可以测量单个细胞 内 pH 和多种离子(Ca2+、K+ 、Na+ 、Mg2+)在活细胞内的浓度及变化。 一般 来说,电生理记录装置加摄像技术检测细胞内离子量变化的速度相对 较快,但其图像本身的价值较低,而激光扫描共聚焦显微镜可以提供更 好的亚细胞结构中钙离子浓度动态变化的图像,这对于研究钙等离子 细胞内动力学有意义。

2.5 三维图像的重建 传统的显微镜只能形成二维图像， 同一样品不同层面的实时扫描成像，进行图像叠加可构成样品的三维 结构图像。 它的优点是可以对样品的立体结构分析，能十分灵活、直观 地进行形态学观察,并揭示亚细胞结构的空间关系。

2.6 荧光漂白恢复技术 该方法的原理是一个细胞内的荧光分子被激光漂白或淬灭，失去 发光能力，而邻近未被漂白细胞中的荧光分子可通过缝隙连接扩散到 已被漂白的细胞中，荧光可逐渐恢复。 可通过观察已发生荧光漂白细 胞其荧光恢复过程的变化量来分析细胞内蛋白质运输、受体在细胞膜 上的流动和大分子组装等细胞生物学过程。

2.7 长时程观察细胞迁移和生长 活细胞观察通常需要一定的加热装置及灌注室，以保持培养液的 适宜温度及 CO2 浓度的恒定。 目前的激光扫描共聚焦显微镜，其光子 产生效率已大大改善，与更亮的物镜和更小光毒性的染料结合后可以 减小每次扫描时激光束对细胞的损伤,用于数小时的长时程定时扫描, 记录细胞迁移和生长等细胞生物学现象。

 3.激光扫描共聚焦显微镜的样品制备技术

3.1 取材 组织标本：包括活检标本、手术切除标本、动物模型标本及尸检解 剖标本等， 应在标本离体后立即冰冻切片或贮存于-70℃冰箱备用， 以充分保存组织的抗原性。 细胞标本：根据培养的细胞特性分别采取不同的方法。 纤维细胞、 粘液癌细胞等贴壁生长的细胞只需将玻片插入培养液即可收集到理 想标本；某些细胞只能在培养液中生长，则必须将培养液经过沉淀离 心涂片法处理。

 3.2 固定 固定的目的是使构成组织细胞成分的蛋白等物质不溶于水和有机溶剂，并迅速使组织细胞中各种酶降解、失活，防止组织自溶和抗性弥散，保持组织细胞的完整性和所要检测物质的抗原性。 固定方法有 浸入法、灌注法、AMEX（改良的冰冻置换法）、微波固定等。 常用的固定剂包括如下几种。 （1）醛类固定剂：双功能交联剂，使组织之间相互交联，保存抗原 于原位，其特点是对组织穿透能力强，收缩性小，是常用的固定剂。 （2）非醛类固定剂：如碳化二亚胺、二甲基乙酰胺、二甲基辛酰胺、 对苯醌等，适用于多肽类激素的组织固定，可与戊二醛或多聚甲醛混合使用。 （3）丙酮及醇类固定剂：适用于免疫细胞化学染色的固定剂，其作 用是沉淀蛋白质和糖，对组织的穿透性强，保存抗原的免疫活性较好， 可与冰醋酸、乙醚、氯仿、甲醛等混合使用。

 3.3 封片 盖玻片与载玻片之间用甘油与 PBS 混合液封片， 甘油具有抗荧光淬灭的作用。 对于活细胞， 则可使其悬浮于相应的溶液中，直接滴片和封片，立即观察，不加上述封片剂。

 3.4 其他制备要求

3.4.1 载玻片、盖玻片：载玻片厚度在 0.8—1.2mm，表面光洁、厚度 均匀，无明显自发荧光。 盖玻片的厚度通常为 0.17mm 左右。

 3.4.2 组织切片或细胞标本不能太厚， 并且应避免细胞重叠或杂 质掩盖。

4.激光扫描共聚焦显微镜的日常管理与维护

4.1 严格按照操作规则使用， 避免因使用不当造成损坏。

 4.2 为保持良好工作状态，延长使用寿命，工作环境应保持清洁、 干燥、远离辐射源。 每次使用后，要做好清洁工作，及时清洁目镜、物镜 等容易污染的光学部件。

4.3 系统应设立专门房间， 安装在防震台上， 工作间内要安装空 调， 抽湿及防尘装置。 无论仪器是否工作， 最好使其环境始终保持在 22℃±1℃的恒温。

4.4 注意保护仪器的光纤， 防止被挤压， 仪器常用的零配件及专 用工具由专门人员负责保管。

4.5 仪器工作间必须常年保持清洁、卫生。

4.6 使用者必须培训合格后， 在管理人员的指导下， 方可上机操作。