应用于激光共聚焦显微镜的组织切片样品多采用冷冻组织切片，可尽量保持组织样品的抗原活性。组织采集后，经固定、冷冻包埋、冷冻切片、晾片，进行免疫荧光抗体标记。
1组织的采集、固定和保存不同来源的组织可依据实验条件和实验目的而采用不同的固定和保存方法。实验室通常采用液氮冷冻法和多聚甲醛(PFA)固定法。 液氮冷冻法:采取新鲜组织后,即可放入液氮中保存。 多聚甲醛固定法:小鼠、大鼠等实验动物经生理盐水和 4% PFA 灌流，采取组织，组织块尽量小于 1 cm × 1 cm × 1 cm，置于 4% PFA 中进行后固定，固定的时间可根据组织块的大小和致密程度而调整，可以 4 ℃ 固定过夜，或室温 1 ～ 4 h。之后，用 0. 01 mol /L PBS 缓冲液洗 3 次，每次 10 ～ 30 min。 在 20% 蔗糖中 4 ℃浸泡 1 h 以上，待组织块下沉后， 即可进行冷冻切片。组织块可置于 4 ℃冰箱保存于 20% 蔗糖(含 0. 05% NaN3 )中，一个月内完成切片。 表达荧光蛋白的实验动物组织，可遵循以上方法处理样品。有些组织样品，如小型实验动物胚胎以及 需同时采集样品进行 DNA 、蛋白质提取时，可根据实验情况和条件采集新鲜组织，直接进行化学试剂固定。实验室通常配制 10% PFA 储液，称取 10g 多 聚甲醛 ( SIGMA，Produce No. : P6148 ) 粉 末，置 于 250 mL 锥形瓶中，加入80 mL 0. 01 mol /L PBS，再加 入 5 ～ 6 滴 10 N NaOH，于 65 ℃ 水浴中溶解 3 ～ 4 h，待完全溶解后冷却至室温，调 pH 值至 7. 4，溶液定容至 100 mL，过滤后分装成每管 4 mL 或 8 mL， 保存于 － 20 ℃。使用前将储液置于 80 ℃ 水浴中融化，用 0. 01 mol /L PBS 稀释至 4% ，即可使用。(4% PFA 工作 液 配 好 后 可 以 4 ℃ 密 闭 保 存，24 h 内 使用。)
2 组织的冷冻包埋和切片 组织的冷冻方法可根据固定和保存条件不同而不同，尽可能加快冷冻速度以力求减少组织在冷 冻过程中冰晶的形成。组织冷冻后，使用冷冻切片机，将组织切成 5 ～ 15 μm 的切片，粘贴于处理过的载玻片上，室温干燥 1 h 后，可进行免疫荧光抗体标记。或放入载玻片盒，－ 80 ℃密闭保存。 气体 CO2 冷冻包埋法:新鲜组织样品块以及经液氮冷冻固定和化学试剂固定的样品块都可采用此方法冷冻。现将组织块放在滤纸上吸取表面液体，放入样品台的冷冻包埋剂(OCT) 中，调整样品位置，打开钢瓶开关使压缩 CO2 气体喷出，迅速冷冻组织样品。冷冻后的样品转移至 － 20 ℃ 冰箱或 冷冻切片机中，使样品温度平衡至切片温度(通常冷冻切片机箱体温度设定为 － 20 ℃，也可依据组织 致密度和环境温度而适当调整)，即可切片，也可以 置于 － 80 ℃密闭保存，一周内完成切片。 干冰冷冻包埋法:此方法适合小块和致密度低的组织，如实验动物胚胎、小块组织、活检组织等。 将经过 4% PFA 固定及 20% 蔗糖浸泡过的小组织 块放入冷冻包埋模具中，小心去除周围的蔗糖液体，调整位置(根据切片方向调整，必要时可在体视镜下操作后，置于干冰上(临时无干冰，也可置于 － 80 ℃冰箱)，待冷冻完全后，将样品移至冷冻切片机中，温度平衡后，将样品从冷冻包埋模具中取出， 进行冷冻切片。液氮冷冻法:成年小鼠和大鼠的脑及稍大一些 的组织块也可采用此方法冷冻。将组织块置于样 品台的 OCT 中，为防止组织块爆裂，先在液氮中迅速浸提几次，时间从 1 s 开始逐渐增加，直至样品温 度与液氮温度平衡，之后移至冷冻切片机中，使温度与切片机箱体温度一致，进行冷冻切片。 直接冷冻法:将样品直接粘着在涂有 OCT 的样 品台上，于冷冻切片机(箱体温度在 － 20 ℃以下)中 直接冷冻。
3 冷冻组织切片的免疫荧光标记将冷冻组织切片从 － 80 ℃ 冰箱中取出，室温放 置 10 min，待切片回温并干燥，浸于 PBS 中 10 min 洗去 OCT，可以无需 Triton 处理，即可进行免疫荧光 抗体标记，操作步骤与培养细胞反应方法相同 。 反应在避光湿盒中进行，反应结束时用无荧光封固剂封片，4 ℃保存。先用荧光显微镜观察，确认标记成功，移至激光共聚焦显微镜扫描成像。 4 荧光染料及荧光蛋白 传统应用于荧光标记的染料如异硫氰酸荧光素(fluorescin isothiocyanate，FITC，ex 490 nm /em 520 nm)、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC，ex 550 nm /em 620 nm)、罗丹明(Rhodamine，ex 560 nm /em 540 ～ 660 nm)、四 甲 基 罗 丹 明 ( tetramethyl rhodamine， TMR，ex 570 nm /em 595 ～ 600 nm)、德 克 萨 斯 红 (Texas red，ex 592 nm /em 610 nm)、氨甲基香豆素 ( Aminomethylcoumarin acetic acid，AMCA，ex 345 nm /em 425 nm)等，结合激光共聚焦显微镜技术的发展，这些经典的荧光染料逐渐被层出不穷的新的荧光染料所替代。如 Cyanine 类荧光染料，其中 Cy3 (ex554 nm /em568 nm)的激发峰值更接近于新型固 体 561 nm 激光器，且比 TRITC 等更亮、更稳定，已 被广为应用于免疫荧光抗体标记 ;Alexa Fluor 系列荧光染料激发和发射光谱窄，可用于多重荧光标 记而更少光谱重叠;ATTO 系列荧光染料具有较强 的光 稳 定 性 和 热 稳 定 性，已 被 应 用 于 STED (Stimulated Emission Depletion 受激发射损耗)超高分辨率显微成像技术 ;DyLigh、CF 等更多新型荧 光染料系列都将因其较高的激发效率、良好的光稳 定性、宽泛的 PH 稳定性等优越的特性而被广泛的 应用于组织及细胞免疫荧光标记。 组织切片的细胞核标记目前仍然采用 DAPI(4， 6-联脒-2-苯基吲哚，ex 359 nm / em 461 nm)，其特 点是专一性强、灵敏度高、稳定性好、毒性小，且可 被 405 nm 激光器有效地激发，获取明亮的核标记荧 光图像。PI(碘化丙啶 ex 536 nm / em 617 nm)也可 以用于核标记，因其可识别 DNA 和 RNA，核染色前须进行适当的 RNA 酶处理。TOTO 系列、YOYO 系 列荧光染料也可作为组织细胞核荧光染料。 表达荧光蛋白的组织经冷冻切片制样后，可直接封片，观察并扫描图像，也可配合使用其它荧光 染料进行免疫荧光抗体标记和核染色。同时表达 GFP 和 RFP 荧光蛋白的组织切片，如还需作免疫荧光抗体标记，应选择可以被 633 nm 和 405 nm 波长 激光器激发的荧光染料，如 CY5、Alexa fluor 633 和 Alexa fluor405 等。
5 样品制备中相关实验方法用于免疫荧光抗体标记组织切片的载玻片需经过明胶、蛋白胶、多聚赖氨酸( Poly-L-Lysine)、硅 烷(3-氨丙基三乙氧基硅烷，APES)等处理，以粘贴 组织切片，防止组织切片在免疫反应过程中脱落。 简易明胶处理方法是将干净的载玻片浸于 0. 1% 明 胶热溶液中一分钟，取出沥干，65 ℃烘烤 1h，放至室 温即可使用。0. 5% 明胶 － 硫酸铬钾处理方法是溶 解 4 g 明胶和 4 g 硫酸铬钾于 800 mL d2H2O 中，65 ℃加热 30 min 左右，使其溶解(不要使溶液沸腾) 后，过滤溶液，并将溶液在室温下放置至 50 ℃左右， 将玻片在溶液中浸提 3 ～ 4 次，在室温下过夜使其蒸 发干，为防止灰尘，用保鲜膜覆盖，130 ℃烤干3 h 以 上，干燥保存备用。处理液使用后，可加入 0. 05% NaN3，4 ℃ 保存，下次处理载玻片时将溶液加热至 50 ℃即可。大量处理过的载玻片，可以收集于载玻片盒中，放在干燥箱中长期保存。蛋白胶处理方法简便易行，多用于样品量不多的情况，取新鲜鸡蛋 清充分搅拌，4 ℃ 过滤，清液加入等体积无荧光甘 油，再加 入 0. 05% NaN3 充 分 混 合，分 装 成 每 管 1 mL，－ 20 ℃ 保存，使用时室温融化，取少量蛋白胶 均匀涂抹在干净的载玻片上，40 ℃ 烘干，放至室温即可使用。目前国内可以采购到明胶、多聚赖氨 酸、硅烷等处理过的载玻片，大大节省了样品制备的准备时间。 免疫荧光抗体标记后需用盖玻片进行组织切片封片，尽量选用 0. 13 ～ 0. 17 μm 厚度的盖玻片。 Fisher 等公司的盖玻片厚度均匀，透光性好，对于获取效果好的荧光图像非常重要。 对于荧光标记过的样品应该用无荧光封固剂封片，并尽量选择封片后可以凝固的无荧光封固剂，如 Mowiol 4 ～ 88。如果临时封片，也可以封于 50% 甘油 中，此时应尽量使用最少体积的液体，以减少样品 移动。配制 Mowiol 封固剂时，在 50 mL 离心管中加 入 2. 4 g Mowiol、6 g 甘油和 6 mL 去离子水，室温摇 摆 2 h，使 Mowiol 完全长大透明;再加入 12 mL 0. 2 mol /L Tris 溶 液 ( pH8. 5 )，50 ℃ 摇 摆 过 夜，直 至 Mowiol 完全溶解;4 000 ～ 5 000 rpm 离心 20 min;分 装成每管 1 mL，－ 20 ℃ 保存。使用时室温融化，通 常每个22 mm × 22 mm 组织切片滴加15 ～ 20 μL，覆 盖盖玻片，注意切勿加过量封片剂。封片后，避光 放置于室温 4 h 或过夜，待封片剂凝固后，即可在荧光显微镜油镜下观察，进而进行激光共聚焦显微镜 图像扫描，以上样品可收集于载玻片盒中 4 ℃保存。 除冷冻组织切片外，其它生物学样品可根据组 织特性及实验需求，采取不同的制备技术，进行激 光共聚焦观察成像。如微小生物压片、植物压片可以用无荧光封固剂封片，随即观察。新鲜动物组织 印片经热固定、荧光标记后，进行观察成像。表达 荧光蛋白的小型实验动物整体样品，如:果蝇、斑马 鱼、小鼠胚胎、鸡胚、小型组织器官等可以用无荧光 封固剂封于有浅层小室的载玻片中，进行光学切片观察和三维成像。石蜡组织切片样品经常规的石 蜡切片、免疫荧光抗体标记，也可进行激光共聚焦显微镜成像。
应用于激光共聚焦显微镜的组织切片样品多采用冷冻组织切片，可尽量保持组织样品的抗原活性。组织采集后，经固定、冷冻包埋、冷冻切片、晾片，进行免疫荧光抗体标记。
1组织的采集、固定和保存不同来源的组织可依据实验条件和实验目的而采用不同的固定和保存方法。实验室通常采用液氮冷冻法和多聚甲醛(PFA)固定法。 液氮冷冻法:采取新鲜组织后,即可放入液氮中保存。 多聚甲醛固定法:小鼠、大鼠等实验动物经生理盐水和 4% PFA 灌流，采取组织，组织块尽量小于 1 cm × 1 cm × 1 cm，置于 4% PFA 中进行后固定，固定的时间可根据组织块的大小和致密程度而调整，可以 4 ℃ 固定过夜，或室温 1 ～ 4 h。之后，用 0. 01 mol /L PBS 缓冲液洗 3 次，每次 10 ～ 30 min。 在 20% 蔗糖中 4 ℃浸泡 1 h 以上，待组织块下沉后， 即可进行冷冻切片。组织块可置于 4 ℃冰箱保存于 20% 蔗糖(含 0. 05% NaN3 )中，一个月内完成切片。 表达荧光蛋白的实验动物组织，可遵循以上方法处理样品。有些组织样品，如小型实验动物胚胎以及 需同时采集样品进行 DNA 、蛋白质提取时，可根据实验情况和条件采集新鲜组织，直接进行化学试剂固定。实验室通常配制 10% PFA 储液，称取 10g 多 聚甲醛 ( SIGMA，Produce No. : P6148 ) 粉 末，置 于 250 mL 锥形瓶中，加入80 mL 0. 01 mol /L PBS，再加 入 5 ～ 6 滴 10 N NaOH，于 65 ℃ 水浴中溶解 3 ～ 4 h，待完全溶解后冷却至室温，调 pH 值至 7. 4，溶液定容至 100 mL，过滤后分装成每管 4 mL 或 8 mL， 保存于 － 20 ℃。使用前将储液置于 80 ℃ 水浴中融化，用 0. 01 mol /L PBS 稀释至 4% ，即可使用。(4% PFA 工作 液 配 好 后 可 以 4 ℃ 密 闭 保 存，24 h 内 使用。)
2 组织的冷冻包埋和切片 组织的冷冻方法可根据固定和保存条件不同而不同，尽可能加快冷冻速度以力求减少组织在冷 冻过程中冰晶的形成。组织冷冻后，使用冷冻切片机，将组织切成 5 ～ 15 μm 的切片，粘贴于处理过的载玻片上，室温干燥 1 h 后，可进行免疫荧光抗体标记。或放入载玻片盒，－ 80 ℃密闭保存。 气体 CO2 冷冻包埋法:新鲜组织样品块以及经液氮冷冻固定和化学试剂固定的样品块都可采用此方法冷冻。现将组织块放在滤纸上吸取表面液体，放入样品台的冷冻包埋剂(OCT) 中，调整样品位置，打开钢瓶开关使压缩 CO2 气体喷出，迅速冷冻组织样品。冷冻后的样品转移至 － 20 ℃ 冰箱或 冷冻切片机中，使样品温度平衡至切片温度(通常冷冻切片机箱体温度设定为 － 20 ℃，也可依据组织 致密度和环境温度而适当调整)，即可切片，也可以 置于 － 80 ℃密闭保存，一周内完成切片。 干冰冷冻包埋法:此方法适合小块和致密度低的组织，如实验动物胚胎、小块组织、活检组织等。 将经过 4% PFA 固定及 20% 蔗糖浸泡过的小组织 块放入冷冻包埋模具中，小心去除周围的蔗糖液体，调整位置(根据切片方向调整，必要时可在体视镜下操作后，置于干冰上(临时无干冰，也可置于 － 80 ℃冰箱)，待冷冻完全后，将样品移至冷冻切片机中，温度平衡后，将样品从冷冻包埋模具中取出， 进行冷冻切片。液氮冷冻法:成年小鼠和大鼠的脑及稍大一些 的组织块也可采用此方法冷冻。将组织块置于样 品台的 OCT 中，为防止组织块爆裂，先在液氮中迅速浸提几次，时间从 1 s 开始逐渐增加，直至样品温 度与液氮温度平衡，之后移至冷冻切片机中，使温度与切片机箱体温度一致，进行冷冻切片。 直接冷冻法:将样品直接粘着在涂有 OCT 的样 品台上，于冷冻切片机(箱体温度在 － 20 ℃以下)中 直接冷冻。
3 冷冻组织切片的免疫荧光标记将冷冻组织切片从 － 80 ℃ 冰箱中取出，室温放 置 10 min，待切片回温并干燥，浸于 PBS 中 10 min 洗去 OCT，可以无需 Triton 处理，即可进行免疫荧光 抗体标记，操作步骤与培养细胞反应方法相同 。 反应在避光湿盒中进行，反应结束时用无荧光封固剂封片，4 ℃保存。先用荧光显微镜观察，确认标记成功，移至激光共聚焦显微镜扫描成像。 4 荧光染料及荧光蛋白 传统应用于荧光标记的染料如异硫氰酸荧光素(fluorescin isothiocyanate，FITC，ex 490 nm /em 520 nm)、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC，ex 550 nm /em 620 nm)、罗丹明(Rhodamine，ex 560 nm /em 540 ～ 660 nm)、四 甲 基 罗 丹 明 ( tetramethyl rhodamine， TMR，ex 570 nm /em 595 ～ 600 nm)、德 克 萨 斯 红 (Texas red，ex 592 nm /em 610 nm)、氨甲基香豆素 ( Aminomethylcoumarin acetic acid，AMCA，ex 345 nm /em 425 nm)等，结合激光共聚焦显微镜技术的发展，这些经典的荧光染料逐渐被层出不穷的新的荧光染料所替代。如 Cyanine 类荧光染料，其中 Cy3 (ex554 nm /em568 nm)的激发峰值更接近于新型固 体 561 nm 激光器，且比 TRITC 等更亮、更稳定，已 被广为应用于免疫荧光抗体标记 ;Alexa Fluor 系列荧光染料激发和发射光谱窄，可用于多重荧光标 记而更少光谱重叠;ATTO 系列荧光染料具有较强 的光 稳 定 性 和 热 稳 定 性，已 被 应 用 于 STED (Stimulated Emission Depletion 受激发射损耗)超高分辨率显微成像技术 ;DyLigh、CF 等更多新型荧 光染料系列都将因其较高的激发效率、良好的光稳 定性、宽泛的 PH 稳定性等优越的特性而被广泛的 应用于组织及细胞免疫荧光标记。 组织切片的细胞核标记目前仍然采用 DAPI(4， 6-联脒-2-苯基吲哚，ex 359 nm / em 461 nm)，其特 点是专一性强、灵敏度高、稳定性好、毒性小，且可 被 405 nm 激光器有效地激发，获取明亮的核标记荧 光图像。PI(碘化丙啶 ex 536 nm / em 617 nm)也可 以用于核标记，因其可识别 DNA 和 RNA，核染色前须进行适当的 RNA 酶处理。TOTO 系列、YOYO 系 列荧光染料也可作为组织细胞核荧光染料。 表达荧光蛋白的组织经冷冻切片制样后，可直接封片，观察并扫描图像，也可配合使用其它荧光 染料进行免疫荧光抗体标记和核染色。同时表达 GFP 和 RFP 荧光蛋白的组织切片，如还需作免疫荧光抗体标记，应选择可以被 633 nm 和 405 nm 波长 激光器激发的荧光染料，如 CY5、Alexa fluor 633 和 Alexa fluor405 等。
5 样品制备中相关实验方法用于免疫荧光抗体标记组织切片的载玻片需经过明胶、蛋白胶、多聚赖氨酸( Poly-L-Lysine)、硅 烷(3-氨丙基三乙氧基硅烷，APES)等处理，以粘贴 组织切片，防止组织切片在免疫反应过程中脱落。 简易明胶处理方法是将干净的载玻片浸于 0. 1% 明 胶热溶液中一分钟，取出沥干，65 ℃烘烤 1h，放至室 温即可使用。0. 5% 明胶 － 硫酸铬钾处理方法是溶 解 4 g 明胶和 4 g 硫酸铬钾于 800 mL d2H2O 中，65 ℃加热 30 min 左右，使其溶解(不要使溶液沸腾) 后，过滤溶液，并将溶液在室温下放置至 50 ℃左右， 将玻片在溶液中浸提 3 ～ 4 次，在室温下过夜使其蒸 发干，为防止灰尘，用保鲜膜覆盖，130 ℃烤干3 h 以 上，干燥保存备用。处理液使用后，可加入 0. 05% NaN3，4 ℃ 保存，下次处理载玻片时将溶液加热至 50 ℃即可。大量处理过的载玻片，可以收集于载玻片盒中，放在干燥箱中长期保存。蛋白胶处理方法简便易行，多用于样品量不多的情况，取新鲜鸡蛋 清充分搅拌，4 ℃ 过滤，清液加入等体积无荧光甘 油，再加 入 0. 05% NaN3 充 分 混 合，分 装 成 每 管 1 mL，－ 20 ℃ 保存，使用时室温融化，取少量蛋白胶 均匀涂抹在干净的载玻片上，40 ℃ 烘干，放至室温即可使用。目前国内可以采购到明胶、多聚赖氨 酸、硅烷等处理过的载玻片，大大节省了样品制备的准备时间。 免疫荧光抗体标记后需用盖玻片进行组织切片封片，尽量选用 0. 13 ～ 0. 17 μm 厚度的盖玻片。 Fisher 等公司的盖玻片厚度均匀，透光性好，对于获取效果好的荧光图像非常重要。 对于荧光标记过的样品应该用无荧光封固剂封片，并尽量选择封片后可以凝固的无荧光封固剂，如 Mowiol 4 ～ 88。如果临时封片，也可以封于 50% 甘油 中，此时应尽量使用最少体积的液体，以减少样品 移动。配制 Mowiol 封固剂时，在 50 mL 离心管中加 入 2. 4 g Mowiol、6 g 甘油和 6 mL 去离子水，室温摇 摆 2 h，使 Mowiol 完全长大透明;再加入 12 mL 0. 2 mol /L Tris 溶 液 ( pH8. 5 )，50 ℃ 摇 摆 过 夜，直 至 Mowiol 完全溶解;4 000 ～ 5 000 rpm 离心 20 min;分 装成每管 1 mL，－ 20 ℃ 保存。使用时室温融化，通 常每个22 mm × 22 mm 组织切片滴加15 ～ 20 μL，覆 盖盖玻片，注意切勿加过量封片剂。封片后，避光 放置于室温 4 h 或过夜，待封片剂凝固后，即可在荧光显微镜油镜下观察，进而进行激光共聚焦显微镜 图像扫描，以上样品可收集于载玻片盒中 4 ℃保存。 除冷冻组织切片外，其它生物学样品可根据组 织特性及实验需求，采取不同的制备技术，进行激 光共聚焦观察成像。如微小生物压片、植物压片可以用无荧光封固剂封片，随即观察。新鲜动物组织 印片经热固定、荧光标记后，进行观察成像。表达 荧光蛋白的小型实验动物整体样品，如:果蝇、斑马 鱼、小鼠胚胎、鸡胚、小型组织器官等可以用无荧光 封固剂封于有浅层小室的载玻片中，进行光学切片观察和三维成像。石蜡组织切片样品经常规的石 蜡切片、免疫荧光抗体标记，也可进行激光共聚焦显微镜成像。